mile米乐体育天然产品化学试验之α

　　试剂及设备3,5-二硝基水杨酸试剂DNS；葡萄糖规范液10mgml；福林试剂；淀粉溶液10mgml；磷酸盐缓冲液pH60，002molL。722型或721型分光光度计；4000rmin的离心机；分析天平。原理与办法31Folin-酚试剂测定蛋白含量Folin-酚试剂法包含两步反响：第一步是在碱性条件下，蛋白质与铜效果生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物将磷钼酸-磷钨酸试剂Folin试剂复原，发生深蓝色磷钼蓝和磷钨蓝混合物，色彩深浅与蛋白质含量成正比。此法操作简洁，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量规模为5～100μg蛋白质。Folin试剂显色反响由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因而样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有搅扰效果。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。32淀粉酶活性测定淀粉是植物最首要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的根本质料。淀粉经淀粉酶效果后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体使用。淀粉酶首要包含α-55淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地效果于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等复原糖，一同使淀粉的粘度下降，因而又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非复原性结尾进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化发生的这些复原糖能使3,5-二硝基水杨酸复原，生成棕赤色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反响式如下：3,5-二硝基水杨酸3-氨基-5-硝基水杨酸棕赤色淀粉酶生机的巨细与发生的复原糖的量成正比。用规范浓度的麦芽糖溶液制造规范曲线，用比色法测定淀粉酶效果于淀粉后生成的复原糖的量，以单位分量样品在必定时刻内生成的麦芽糖的量表明酶生机。淀粉酶存在于简直一切植物中，特别是萌生后的禾谷类种子，淀粉酶生机最强，其间首要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH36以下敏捷钝化。β-淀粉酶不耐热，在7015min化。依据它们的这种特性，在测定生机时钝化其间之一，就可测出另一种淀粉酶的生机。本试验选用加热的办法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的生机。在非钝化条件下测定淀粉酶总生机α-淀粉酶生机+β-淀粉酶生机，再减去α-淀粉酶的生机，就可求出β-淀粉酶的生机。41Folin-酚试剂测定蛋白含量按ppt课件为准，以下仅供参考411规范曲线;制造规范牛血清白蛋白溶液：在分析天平上准确称取00250g结晶牛血清白蛋白，倒入小烧杯内，用少数蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少数蒸馏水冲刷数次，冲刷液同时倒入容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，则配成250μgmL的牛血清白蛋白溶液。2系列规范牛血清白蛋白溶液的制造：取6支一般试管，按表1参加规范浓度的牛血清白蛋白溶液和蒸馏水，配成一系列不同浓度的牛血清白蛋白溶液。然后各加试剂甲5mL，混合后在室温下放置10min，再各加05试剂乙，当即混合均匀这一步速度要快，不然会使显色程度削弱。30min后，以不含蛋白质的1号试管为对照，用722型分光光度计于500-650nm波长下测定各试管中溶液的光密度并记载成果。3规范曲线的制作：以牛血清白蛋白含量μg为横坐标，以光密度为纵坐标制作规范曲线。牛血清白蛋白规范曲线蒸馏水mL100806040412样品测定将各峰搜集的样品经必定稀释后，按规范曲线的过程进行测定。以缓冲液作为空白对照。42淀粉酶活性测定421规范曲线，40，50，60ml50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每毫升含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200ug的规范溶液，按表A1的操作过程一同反响。以葡萄糖含量为纵坐标05ml以上稀释液葡萄糖含量分别为：100、200、300、400、500、600μg，以吸光值为横坐标，制作规范曲线样品测定将各峰搜集的样品经必定稀释后按下表所示过程操作，在反响过程中，从参加底物开端，向每支管中参加试剂的时刻距离要肯定共同：表A1反响次序样品，规范样品空白规范空白样品稀释液ml05050550预热5min顺次参加淀粉溶液ml1515第二步15第二步顺次参加DNS试剂ml3030第一步30第一步混合蒸馏水ml101010混合均匀总体积ml150150150反响后的试样在室温下静置10min，如呈现混浊需在离心机上以4000rpm离心10min，上清液以规范空白调零，在分光光度计540nm波利益测定样品空白A为实测吸光值。用直线回归方程核算样品淀粉酶的活性。423活性核算酶生机单位界说：在60、PH60条件下，每小时从1％的可溶性淀粉溶液中释放出1微摩尔葡萄糖的酶量界说为1个酶生机单位U淀粉酶活性U按下式核算：中S＝05ml；60—1小时为60min；30—反响时刻，min；180—葡萄糖的分子量。两个平行样品的测定成果用算术平均值表明，保存整数。数据处理依据各组分蛋白质含量和淀粉酶活性测定成果，能够核算各组分的比活生机单位蛋白质含量；将原液、DEAE各峰的比活成果核算出来，并阐明那个部分生机最强，以此核算DEAE的纯化倍数。

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