mile米乐体育试验一--淀粉酶发生菌的别离及酶活性测定

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　　1、精选优质文档-倾情为你奉上 本科学生试验报告学号： 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术班 试验课程名称： 酶工程试验一 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印试验一 淀粉酶发生菌的别离及酶活性测定一、意图要求1、把握从土壤中别离酶发生菌的办法，学会运用微生物生态常识别离产酶微生物。2、把握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定办法。二、基本原理（一）淀粉酶发生菌的别离1.菌种的搜集要取得发生某种酶的菌种，可从富含该酶效果底物的场所去搜集。胞外酶的稳定性和最适反响条件一般和菌的最适成长条件共同，因此要挑选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。2.富集培育原

　　2、理：搜集到的样品中假如所需的菌很少，需求先通过富集培育，使所需的菌很多繁衍，而不需求的菌则不成长或少成长，以利于挑选。富集的办法：操控培育的温度、pH和营养成分等。 3.菌种的别离淀粉与碘液反响会构成蓝色化合物。淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反响不会构成蓝色化合物，成果可使淀粉酶发生菌周围构成通明圈，然后挑选出淀粉酶发生菌。（二）淀粉酶发生菌的发酵及葡萄糖规范曲线.原理：依据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕赤色的氨基化合物，在必定的范围内，还原糖的量和反响液的色彩呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。2.酶活界说：在必定pH5.

　　3、5、 37条件下，每分钟内从底物溶液平分解开释1mol葡萄糖所需求的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式：酶活（U/g）=A5KN1000/（TW）A:样品的OD值(平均值) K:规范曲线的斜率 N:稀释倍数 5:0.2毫升反响液转化为1毫升体积 T:反响时刻（min） 1000:转化因子1mmol=1000mol W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）3制作规范曲线先制造一系列浓度不同的规范溶液，用选定的显色剂进行显色，在必定波长下别离测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线、然后运用用完全相同的办法和过程测定被测溶液的吸光度，便可从规范曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量三、器件1试剂:可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO412H2O等2培育基:别离、纯化培育基3仪器:平皿、 三角瓶、大试管、 1mL和10mL移液枪、涂棒；天平、超净工作台、培育箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。四、操作过程（一）淀粉酶发生菌的别离1.培育基的制造及灭菌倒平板制造别离培育基 高压灭菌30min 冷却至约50倒7块平板/140mL 冷却备用2.制备土壤稀释液称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇摆1

　　5、0min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，参加盛有9mL无菌水的大试管中，充沛混匀，制备得到10-2土壤稀释液；再从中吸出1mL参加盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；以此类推，别离制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。3.涂布用无菌吸管别离汲取10-3、10-4、10-5 、10-6 和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入现已写好记号的平板中心，用无菌玻璃涂棒涂匀。4.培育纯化挑取其间通明圈较大的单菌落，划线d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到取得纯培育)。5.产淀粉酶微生物的鉴定向

　　6、平板内参加稀碘液数滴后进行调查（二）淀粉酶发生菌的发酵及葡萄糖规范曲线.淀粉酶发生菌的发酵别离培育基（140mL）的制造：可溶性淀粉：0.7g 蛋白胨：0.7g 酵母膏：0.7gKH2PO4 : 0.07g MgSO47H2O :0.02g CaCl22H2O : 0.08g琼脂 : 2.8g装备发酵培育基200mL/组（40mL/瓶） 将纯培育得到的（通明圈最大的） 菌落接种于发酵培育基中30 150r/min摇瓶发酵约72h。2.葡萄糖规范曲线g葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的葡萄糖的规范溶液。规范曲线如下图表所示：葡萄糖规范溶液

　　8、冲液定容至100mL。 注：假如测定所得OD值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地下降或增大稀释倍数后再进行测定。 淀粉酶酶活测定办法操作过程空白管样品管A样品管B过程1汲取1.8mL可溶性底物溶液汲取1.8mL可溶性底物溶液汲取1.8mL可溶性底物溶液过程237保温5分钟37保温5分钟37保温5分钟过程3参加待测酶液0.2毫升参加待测酶液0.2毫升过程437准确保温15min37准确保温15min37准确保温15min过程5参加3mLDNS试剂停止反响参加3mLDNS试剂停止反响参加3mLDNS试剂停止反响过程6混合均匀混合均匀混合均匀过程7参加0.2毫升待测酶液，沸水浴

　　9、煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min过程8流水冷却流水冷却流水冷却过程9加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀加蒸馏水10mL，混匀过程10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色五、酶活测定注意事项注：1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时掉落；2.移液枪的运用：向试管内参加待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，接连汲取同一种溶液时能够不必更换枪头！3.准确记时：每一管参加酶液的时刻要做记载，每管之间距离的时刻要合理；4.防止试管进水：煮沸和用流水冲刷时；5.试验成果的记载与剖析六、试验报告（一）淀粉酶发生菌的别离

　　12、00/（TW）5 =(0.31050.9479+0.126）11000/(15180.2) 5 = 0.77753、思考题：请你树立一个“筛子”，从土壤中挑选出能发生植酸酶的微生物。答：搜集土样(除土层外表枯枝、 杂草和砂石， 搜集距表层5cm10cm土壤)将搜集的土样进行10 -1 10 -6 梯度稀释后，别离涂布于改进的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培育基上，在30的恒温箱中培育3d，然后调查菌落周围是否构成通明水解圈。由于培育会集含有水溶性较差的植酸钙，因此含植酸钙的平板上会出现污浊态。若菌株代谢发生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围构成通明水解圈，可起到必定指示效果。此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4种常用染色剂增加至平板初筛培育基中，在加深培育基背景色的一起，以增强植酸钙水解后构成的通明圈可见性。专心-专心-专业

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